產品名稱：多肽磷酸化標記技術

產品描述：

      磷酸化影響著細胞生命的方方面面。在細胞中，大概有1/3的的蛋白質被認為是通過磷酸化修飾的。蛋白質的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關，如DNA損傷修復、轉錄調節、信號傳導、細胞凋亡的調節等。磷酸化蛋白質及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機理，進一步認識生命活動的本質。依據自身原料優勢和技術優勢，可以合成含有磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的多肽，并可以提供含有一個，兩個，三個，四個，五個磷酸化位點修飾的高質量多肽。

• 多肽磷酸化標記簡介

        磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質磷酸化過程的必不可少的工具，因此研究蛋白質及多肽的磷酸化反應并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：
        （1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；
        （2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化。
       

  1）將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

  
  

  即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當保護，然后按照正常SPPS合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點。這種方法操作簡便，已經成為多肽單位點磷酸化修飾的主要方法。

       

  2）多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化：

  
  

  采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進行磷酸化修飾時，磷酸化的氨基酸由于側鏈修飾的較大基團產生的位阻而導致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難，尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且最終產物成分復雜，難以分離，產率極低。因此，當肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用將多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化：其合成過程主要就是在多肽合成結束之后，選擇性的脫去要標記氨基酸的側鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應。側鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。采用這種方法時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷酰基，完成反應。

• 檢測蛋白質磷酸化的方法簡介

  激酶活性檢測

  
  

  在體外，激酶活性的檢測是將經免疫沉淀法獲得的蛋白激酶與某一底物在ATP環境下共同孵育，然后再檢測。磷酸化底物的測量可以通過報告系統如比色法、放射性或熒光檢測而得。

  磷酸化特定性抗體的開發

  
  

  磷酸化抗體已被許多研究者使用。合成磷酸化多肽，即圍繞靶蛋白磷酸化位點的氨基酸序列，接著共軛偶聯至血藍蛋白(KLH)上進行免疫。免疫血清將流經多肽親和層析柱， 從而得到一個非常特異的免疫制劑。檢測的成功與否取決于抗體對靶磷酸化蛋白的特異性和親和力。

  免疫印跡（Western Blot）

  
  

  許多磷酸化抗體是十分敏感的，可以很容易地檢測到常規樣品中的磷酸化蛋白。化學發光和比色法都是較常見的檢測方法，蛋白Markers通常用來為蛋白質量提供標準。

  酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

  
  

  ELISAs提供一種間接測量激酶活性的方法，其比WB更容易定量。磷酸化特異的ELISA技術可以很輕易地通過使用一個校準標準來量化結果。通過雙抗體夾心方法，應用兩個靶蛋白的特異性抗體可使檢測呈現高特異性。此外,基于微孔板的ELISAs檢測，更是具有高通量、 微量和對低豐度蛋白檢測的特點。

  細胞ELISA（Cell-Based ELISA）

  
  

  通過分析完整的細胞中磷酸化蛋白，可更準確地反應特性的信號網絡狀態。一般磷酸化抗體多通過熒光或比色法來檢測磷酸化狀態。

  流式細胞術(FCM)和ICC/IHC

  
  

  流式細胞術因其快速、定量、單細胞分析等特點而非常具有優勢。細胞被誘導后，通過甲醛或多聚甲醛將其與磷酸化蛋白交聯固定，然后分析。固定的細胞需經通透處理，以便磷酸化抗體的進入。

  質譜分析（Mass Spectrometry）

  
  

  質譜(MS)技術是一項用于識別磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化殘基序列的便利工具。利 用MS卓越的靈敏度和分辨率，可識別某一單個蛋白質或多肽。但來自磷酸化多肽的信號通常較弱，因而新的技術正在被研發以增強MS信號。這些策略包括固化金屬親和層析，磷酸化抗體的豐富，化學修飾方法和用生物素部份置換磷酸基團。

  xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術

  
  

  Multi-Analyte profiling技術涉及磷酸化抗體的應用和基于微孔板及膜的檢測方式。這些檢測技術可提供大量的數據，卻只需極少量的樣本。然而，這些檢測技術并不比傳統的檢測方法敏感，原因在于潛在的抗體交叉反應

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